<trans-title>Application of Sedimentary Plant Ancient DNA (aDNA) Technology in Paleovegetation Reconstruction

MA RuiFeng; ZHANG Wei; LIU Liang; YANG ChanYu

doi:10.14027/j.issn.1000-0550.2019.121

Volume 38 Issue 6

Dec. 2020

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MA RuiFeng, ZHANG Wei, LIU Liang, YANG ChanYu. Application of Sedimentary Plant Ancient DNA (aDNA) Technology in Paleovegetation Reconstruction[J]. Acta Sedimentologica Sinica, 2020, 38(6): 1179-1191. doi: 10.14027/j.issn.1000-0550.2019.121

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MA RuiFeng, ZHANG Wei, LIU Liang, YANG ChanYu. Application of Sedimentary Plant Ancient DNA (aDNA) Technology in Paleovegetation Reconstruction[J]. Acta Sedimentologica Sinica, 2020, 38(6): 1179-1191. doi: 10.14027/j.issn.1000-0550.2019.121

Application of Sedimentary Plant Ancient DNA (aDNA) Technology in Paleovegetation Reconstruction

doi: 10.14027/j.issn.1000-0550.2019.121

MA RuiFeng^1
,,
ZHANG Wei^{1
,
,},
LIU Liang¹,
YANG ChanYu^{1, 2}

1.
School of Geography, Liaoning Normal University, Dalian, Liaoning 160000, China
2.
Department of Geography, Xinzhou Teachers University, Xinzhou, Shanxi 034000, China

Funds:

National Natural Science Foundation of China 41671005

Distinguished Professor Foundation of Liaoning 60618006

Received Date: 2019-09-25
Publish Date: 2020-12-25

Abstract

Recent advances in sequencing technologies now permit the analysis of plant DNA from fossil samples and enable the reconstruction of paleovegetation at the molecular level. Some studies have suggested that sediment aDNA from sediments is a powerful tool for the reconstruction of paleovegetation. In this study， the basic theory， cientometric statistics， and the development and application of experimental procedures concerning sediment plant aDNA technology are introduced.It shows that this technology is applicable to the study of paleovegetation by inproving taxonomic resolution and enabling more precise estimations of abundance. Although key questions and challenges remain， the technique will become an important aid in paleovegetation reconstruction in the future.
- sedimentary plant aDNA,
- metabarcoding,
- paleovegetation reconstruction,
- prospects

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通讯作者: 陈斌, bchen63@163.com

1.
沈阳化工大学材料科学与工程学院沈阳 110142

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0 引言

了解长时间尺度的植被演化过程对于研究现代植被的分布^[1⁃2]、丰度^[3⁃4]以及遗传基因结构^[5⁃7]至关重要，古植被信息也为过去和未来的气候变化提供了重要的参考^[8]。在古环境重建的研究中，需明确建立一些古气候代用指标来表征并重建当时的气候环境。传统的古植被重建代用指标主要有孢粉、植物大化石及植硅体等^[9⁃11]。利用现代得到的孢粉数据建立环境因子转换函数，可以反演到沉积样品中实现古气候因子的定量重建^[12⁃14]，但此重建的基础主要是基于大区域的孢粉记录，在代表性和区域尺度上均有一定的局限性^[15]。孢粉、植物大化石及植硅体并非是高分辨率且精确完整适用于任何类型沉积物的古植被代用指标，也并非所有植物信息都会以这3种形式进行保存，其中 “沉默”的一部分却无从得到^[10,15]。

Willerslev et al. ^[16]在Science上的一篇关于提取到的西伯利亚和新西兰地区猛犸象及恐龙鸟的古DNA（Ancient DNA, aDNA）的报道，首次开启了分子生物学在古生态环境重建中应用的序幕。此后，分子学技术被广泛应用于众多古环境载体中，如冰川^[17]、湖相沉积^[18⁃20]及海洋沉积^[21⁃23]等。研究表明，aDNA数据对其他古环境代用指标如孢粉、化石等是非常好的补充，是一种最新发展的有效物种鉴定技术。其目前最主流的分析方法是Metabarcoding（DNA条形码技术），已被广泛地应用于古生态学的研究，即从环境样品中提取DNA并结合第二代测序技术来实现对环境样品中所有存在物种的高精度检测，极大地推动了古生态研究的发展，已经成为目前国际古气候古植被研究的热点。因此，本文从沉积植物aDNA的概念、来源、保存、沉积过程、文献计量学统计、技术的发展应用、Metabarcoding及具体实验内容等方面进行了初步总结，并提出对未来研究方向的展望，为相关研究提供新的思路。

2 沉积植物aDNA的文献计量学研究

2.1　基于Web of Science数据库的基本统计学分析

利用Web of Science核心合集进行关键词“Sediment plant ancient DNA”OR“sediment plant aDNA”检索，出版年跨度为1987—2019年，数据库更新时间为2019年10月21日，文献类型共检索到了75条研究型论文（Article），10条综述（Review）及22条会议论文（Proceedings Paper）。其中在8个Web of Science类别占据较大比重，分别为地球科学综合（Geoscience multidisciplinary）（24篇，31.7%）、地球物理（Geography physical）（20篇，26.%）、生态学（ecology）（19篇，24.7%）、生物化学与分子生物学（Biochemistry molecular biology）（12篇，15.6%）、多学科科学（Multidisciplinary sciences）（12篇，15.6%）、进化学（Evolutionary sciences）（11篇，14.3%）。环境科学（Environmental sciences）（10篇，13.0%）及生物学（Biology）（7篇，9.1%）。论文主要来源期刊见表1。从涉及学科及发表期刊来看，沉积植物aDNA研究越来越多被应用到了地理学、环境学、生态学及第四纪地质学等学科，用以解决古气候古生态学中的科学问题。其中高频次引用论文（引用频次> 0，共14篇）集中于在2003—2015年，Molecular Ecology（4），Science（2），Quaterary Science Reviews（2）为主要来源期刊（表2），内容涉及方法探讨与技术应用两大方面。

来源期刊	文献量/篇	百分比/%
Molecular Ecology	8	10.4
Quaternary Science Reviews	6	7.8
Holocene	4	5.2
Plos One	4	5.2
Quaternary International	4	5.2
Science	4	5.2
Science of Total Environment	3	3.9
Applied and Environmental Microbiology	2	2.6
Boreas	2	2.6
Ecology	2	2.6

Table 1. Major journals publishing articles on sediment plant aDNA

作者	出版年份	论文题目	来源期刊	被引频次	DOI
Davis et al. ^[66]	2005	Evolutionary responses to changing climate	Ecology	403	10.1890/03⁃0788
Thomsen et al. ^[62]	2015	Environmental DNA ⁃ an emerging tool in conservation for monitoring past and present biodiversity	Bioligical Conservation	378	10.1016/j.biocon.2014.11.019
Willerslev et al. ^[16]	2003	Diverse plant and animal genetic records from Holocene and Pleistocene sediments	Science	306	10.1126/science.1084114
Thomsen et al.^[67]	2012	Detection of a diverse marine fish fauna using environmental DNA from seawater samples	Plos one	281	10.1371/journal.pone.0041732
Parducci et al. ^[68]	2012	Glacial Survival of Boreal Trees in Northern Scandinavia	Science	189	10.1126/science.1216043
Andersen et al. ^[69]	2012	Meta⁃barcoding of 'dirt' DNA from soil reflects vertebrate biodiversity	Molecular Ecology	119	10.1111/j.1365⁃294X.2011.05261.x
Pedersen et al.^[70]	2015	Ancient and modern environmental DNA	Philosophical Transactions of the Royal Society B⁃Biological Sciences	87	10.1098/rstb.2013.0383
Lydolph et al.^[71]	2005	Beringian paleoecology inferred from permafrost⁃preserved fungal DNA	Applied and Environmental Microbiology	73	10.1128/AEM.71.2.1012⁃1017.2005
Jorgensen et al. ^[72]	2012	A comparative study of ancient sedimentary DNA, pollen and macrofossils from permafrost sediments of northern Siberia reveals long⁃term vegetational stability	Molecular Ecology	72	10.1111/j.1365⁃294X.2011.05287.x
Parducci et al. ^[73]	2013	Molecular⁃and pollen⁃based vegetation analysis in lake sediments from central Scandinavia	Molecular Ecology	53	10.1111/mec.12298
Pedersen et al.^[34]	2013	A comparative study of ancient environmental DNA to pollen and macrofossils from lake sediments reveals taxonomic overlap and additional plant taxa	Quaterary Science Reviews	45	10.1016/j.quascirev.2013.06.006
Bellemain et al. ^[74]	2013	Fungal palaeodiversity revealed using high⁃throughput metabarcoding of ancient DNA from arctic permafrost	Environmental Microbiology	44	10.1111/1462⁃2920.12020
Jorgensen et al. ^[75]	2012	Islands in the ice: detecting past vegetation on Greenlandic nunataks using historical records and sedimentary ancient DNA Meta⁃barcoding	Molecular Ecology	42	10.1111/j.1365⁃294X.2011.05278.x
Epp et al. ^[76]	2015	Lake sediment multi⁃taxon DNA from North Greenland records early post⁃glacial appearance of vascular plants and accurately tracks environmental changes	Quaterary Science Reviews	21	10.1016/j.quascirev.2015.03.027

Table 2. Frequently cited articles on sediment plant aDNA

2.2　沉积植物aDNA的发展及应用

aDNA的研究对于生物遗传学、进化学、考古学、古人类学等相关学科的应用相对广泛，而沉积体系中的植物aDNA正在成为一个新的应用于古环境演变研究中的成熟技术^[77⁃78]。

沉积植物aDNA的研究始于植物孢粉DNA：德国学者Parducci et al.^[68,73,78]首先从瑞典霍尔特贾宁冰湖（Holtjärnen postglacial lake）沉积物中提取到了苏格兰松树和挪威云杉的花粉质体DNA，这些花粉有近10万年的历史，说明植物孢粉DNA在10万年以内可以得到很好的保存。受此启发，Parducci在斯堪的纳维亚采用aDNA技术发现了保存于10.3 ka的本地特有云杉属的DNA，22 ka和177 ka的松属及云杉属的叶绿体DNA，由此证明针叶树可在斯堪的纳维亚半岛上的最后一次冰期间存活，这一结论挑战了当前关于树木生存和扩散是与气候变化相应的主流结论。随后作者在斯堪的纳维亚中部通过两个全新世湖泊样品的采集，发现孢粉与aDNA鉴定科属上存在一定差异，孢粉统计到了46个科属，植物aDNA技术识别到了14个科属，二者综合统计了52个科属。对于古植被重建，运用沉积aDNA技术是一个重要的补充。Parducci作为此技术运用的前驱者，方法与结论同样遭到了质疑：Birks et al. ^[79]认为，Parducci et al. ^[68]并没有足够的证据来证实松属和云杉属的冰期生存问题，首先方法上没有严格排除潜在的污染（如取样器，实验设备等），除此之外也没有考虑到栖息地缺乏、冰消温暖期两个物种消失等情况，而且结论与目前植物生态理论相悖。

新技术的开启可以解决传统方法所不能解决的问题。Epp et al.^[76]在格陵兰北部湖泊沉积物中采用aDNA手段发现了冰后期维管植物，如岩高兰（Empetrum nigrum）等，并认为基于aDNA重建的植被与预期一致，可准确跟踪环境变化。德国学者Zimmermann et al.^[42]在西伯利亚东北部Buor Khaya半岛沉积物中，通过分析沉积aDNA鉴定出了154个科属的植物，孢粉统计出了83个科属，二者共同重建了该区域末次冰期之后的气候，并认为在沉积剖面中，aDNA表现为高分辨率高物种检测丰度的特点，并指出沉积aDNA的种类更多的表现了植物地下生物量的信息。在沉积体中缺乏植物大化石的情况下，采用沉积aDNA和孢粉结合的技术，具有较大优势。Zale et al. ^[17]在斯堪的纳维亚（Scandinavia）威赫塞尔（Weichselian）后期冰盖附近的冰川瓯穴中采用了微体古生物化石、aDNA、孢粉及硅藻分析，恢复了早期冰上植被系统，认为灌木（柳属、桦木属和杜鹃花科）以及落叶松属等植物均存在于末次冰消期。Bremond et al.^[80]提取了非洲西部贝宁希利湖（Lake Sele）湖相沉积DNA，进一步论证了热带地区古NDA存在的可能并发现了22科21属的植物，该结果与孢粉结果重叠性很小，分类对本地植物指示性较强。研究还鉴定到了外来物种地瓜，可见，此技术除了可以较强针对性地重建本地植被还可用于早期农业耕作历史方面的研究。Heinecke et al.^[81]通过沉积aDNA技术结合碳氮元素比及同位素（δ ¹³C, δ ¹⁵N）研究了帕米尔高原仿羔皮湖（Lake Karakul）29 ka以来水下植物组成生物量变化，清晰展示了水位变动与古植物多样性的关系。Alsos et al.^[20]通过分析斯瓦尔巴特群岛湖泊沉积物，将aDNA技术与植物大化石鉴定对比，aDNA方法额外鉴定出了更多的植物种类：6种维管束植物、2种藻类及12种苔藓类，且每份样品中检测到的种类都要多于大化石，未保存大化石的时期，植被情况同样可识别且变化不大。其研究表明，植物群在古气候变化中具有一定的“韧性”，气温变动在2 ℃之内的情况下植被不会有较大的变动。Clarke et al.^[82]报道了瓦兰吉尔半岛（Varanger Peninsula）中部（挪威东北部）基于孢粉及沉积aDNA重建的植被及气候，共统计了101个维管植物和17个苔藓植物科属，其86%的科属依然存在于现在植被中，表明现代灌木—冻原群落及其大部分物种早在10 700年就已经存在，而aDNA结果特别显示了水生植物水芒草（Limosella aquatica）和杜鹃（Rhododendron tomentosum）的持续存在，说明整个全新世早期和中期的气候都要比现在温暖，这是依靠传统孢粉所记录不到的气候信息。可见，高分辨率地挖掘到植物保存的化石与分子记录对于古植被演替及环境重建是非常关键的。随着技术本身的发展强化，其检测精度进一步提高，检测信息也愈加丰富，沉积aDNA手段将不仅仅协助揭示植被的局部信息，还将绝大部分取代孢粉的远源及超/低代表性等弊端，更加全面客观展示本地古植被的演替过程。

4 结论与展望

近些年飞速发展的生物分子技术为第四纪环境和考古学研究提供了一个较新的技术支撑，这是一门工具科学。除了古环境（古植被）重建方面，在大型物种灭绝、人类—环境相互作用、生物分类学研究及DNA损伤等研究也有较大应用。然而，新技术的应用并非完美，其对古植被重建的精度方面也受制于较多的因素：首先是技术本身方面，如PCR扩增及测序阶段导致的错误；其次是核酸库的成熟度上；最后是DNA模板质量的优劣，即模板量是否充足及降解，模板的优劣受埋藏条件、物种差异、提取试剂及操作方法影响。因此，从来源上，埋藏条件上，提取扩增及测序技术上，到最后比对上，甚至实验者的实验技术及操作经验等各个环节均会对古植被重建的精度/准确度上产生影响。

沉积植物aDNA已经成为古植被与传统古生态学分析相结合的工具。相对于其他方法，它与植物大化石均侧重于本地植被重建，且在识别“化石沉默”中起到关键作用，DNA分子可更为精确地记录植物组合种群起源、遗传分化及扩散。当然，一些研究的结论也引起了一些学者的质疑，如提取DNA的可信性以及其来源等，都会在未来的研究中得到解答。针对后期的研究，试提出几点研究方向：

沉积植物aDNA生态学方面研究：1）全面开展不同生境下湖泊沉积的赋存状况与环境因子的相关性研究，明确其保存的多种环境条件阈值；2）植物aDNA环境行为学研究，通过环境因子胁迫，如室内模拟不同温度梯度、不同压力、不同保存介质（土壤、水体）下对不同植物种类化石aDNA分子提取量的差异性影响，明确其在环境中的损伤机制与降解周期；3）沉积体系中植物aDNA来源研究，进一步明确其与其他古植被代用指标的重叠性与补充性关系，如在不同植被类型研究区通过植被调查、不同层次土壤DNA提取、孢粉及植物残体鉴定来验证几种方法对植被信息的反应程度及之间的重叠包含关系。

植物aDNA技术方面研究：1）技术应用的科学性论证方面，通过现代生态学过程进行验证；2）实验设计的优化、引物的选择，PCR体系优化、物种条形码的扩充及复合数据库的完善等，即目前还没有一套标准适用于沉积植物aDNA的实验室操作规范，metabarcode依据研究目的的多元化选择，与其匹配引物的设计，最优PCR体系的验证实验、比对数据库的完善等，均需要投入大量的研究。3）植物aDNA应用方面研究：1）扩大研究区域尺度，应用此技术协同传统古生态学方法完善植被重建的物种基础数据，进一步完善建立地方数据库，目前涉及该方法应用的国外报道较多，我国还未大规模开展。2）通过古植被恢复及古植物单体基因测序分析植物遗传分化规律，可对一些第四纪冰川孑遗植物的遗传谱系进行系统研究。

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名称	编号	序列(5’⁃3’)
c	A49235	CGAAATCGGTAGACGCTACG
d	B49863	GGGGATAGAGGGACTTGAAC
g	A49425	GGGCAATCCTGAGCCAA
h	B49466	CCATTGAGTCTCTGCACCTATC